Dopo la perfusione con agenti crioprotettori, il paziente non viene semplicemente immerso nell'azoto liquido.
Il paziente viene sottoposto a un programma di raffreddamento controllato da computer, della durata di diversi giorni. I sensori interni indicano se le diverse regioni anatomiche si raffreddano in modo uniforme o se si formano gradienti termici pericolosi.
Il problema tecnico cambia durante la discesa. Nella fase iniziale il raffreddamento deve limitare la formazione di ghiaccio. Vicino e sotto la transizione vetrosa, la precisione e l'uniformità termica diventano più importanti della velocità.
Perché il raffreddamento controllato è necessario
Gli agenti crioprotettori riducono la velocità di raffreddamento necessaria per evitare il ghiaccio. Permettono ai tessuti ricchi d’acqua di passare a uno stato vetroso, altamente viscoso, anziché formare cristalli in misura estesa.
La temperatura di transizione vetrosa rilevante, indicata con Tg, dipende dalla soluzione, dalla sua concentrazione e dal metodo di misura. Si tratta di un intervallo, non di una soglia biologica universale.
Nelle soluzioni impiegate nella crioconservazione umana, questo intervallo è generalmente compreso tra −120 °C e −135 °C.
Sopra questo intervallo, un raffreddamento troppo lento può permettere la nucleazione e la crescita del ghiaccio. Sotto di esso, il materiale si comporta sempre più come un solido fragile.
Se la superficie si raffredda molto più rapidamente del centro, le diverse regioni si contraggono in misura diversa. Lo stress termomeccanico che ne risulta può produrre fratture.
Ne deriva una sequenza obbligata: raffreddare rapidamente prima della vitrificazione, quindi controllare i gradienti e la velocità di raffreddamento mentre il paziente entra nello stato vetroso.
Per il comportamento di fase alla base di questo processo, si veda la spiegazione della differenza tra congelamento e vitrificazione.
Il sistema di raffreddamento di prima generazione
Il sistema di prima generazione di Tomorrow.bio, denominato V1 cooling box, ha definito l’architettura di base per il raffreddamento controllato dell’intero corpo.
Il paziente viene collocato in un’apposita camera isolata. Un computer controlla l'ambiente criogenico della camera, mentre le termocoppie misurano la temperatura in più punti.
Il regolatore segue una curva programmata invece di applicare in modo continuo il raffreddamento massimo. I dati di ciascun canale del sensore vengono registrati e confluiscono nel tracciato termico del paziente.
Si tratta già di un approccio sostanzialmente diverso dall’immersione diretta. Il sistema può rallentare il raffreddamento, mantenerlo costante o modificare le condizioni della camera in funzione delle misurazioni effettuate sul paziente.
Il sistema di seconda generazione basato su dewar
Il sistema di seconda generazione di Tomorrow.bio realizza il raffreddamento controllato all’interno di un dewar appositamente progettato.
Il paziente resta all’interno del dewar, il cui coperchio appositamente progettato integra i componenti di raffreddamento, il sistema di controllo computerizzato, le valvole, i collegamenti dei sensori e i passacavi per le termocoppie.
Le termocoppie sono posizionate in più punti all'interno del paziente. Sensori aggiuntivi monitorano l'ambiente termico all'interno del dewar.
Il sistema non si limita quindi a mantenere il setpoint impostato: rileva anche la velocità con cui le diverse regioni monitorate del paziente rispondono al raffreddamento.
Il computer regola il gradiente di temperatura del dewar e la velocità di discesa per mantenere queste letture entro i limiti previsti dal protocollo.
Un corpo di grandi dimensioni non può essere perfettamente isotermo durante il raffreddamento. L’obiettivo pratico è ridurre al minimo gli scostamenti e impedire che una regione monitorata si raffreddi in modo pericolosamente più rapido o più lento delle altre.
La geometria del dewar riduce anche le manipolazioni tra il raffreddamento controllato e la conservazione criogenica. Questa configurazione chiusa può inoltre garantire un ambiente stabile e simmetrico attorno al paziente.
Il setpoint di temperatura non è la temperatura del paziente
Un regolatore può raffreddare rapidamente l’ambiente. Non può far corrispondere istantaneamente il centro di un corpo umano a quella temperatura.
Il calore deve spostarsi dai tessuti più profondi verso la superficie. La geometria, la composizione corporea, la distribuzione dei crioprotettori e la posizione dei sensori influenzano il ritardo osservato.
Per questo un solo sensore nella camera non basta. Un ambiente nominalmente a −130 °C non dimostra che ogni parte misurata del paziente abbia raggiunto −130 °C.
Il sistema di controllo deve tenere conto sia della temperatura assoluta sia della differenza tra i canali. Il punto che si raffredda più lentamente, quello che si raffredda più rapidamente e lo scostamento complessivo forniscono informazioni complementari.
Contano anche la calibrazione, il posizionamento e la continuità delle termocoppie. Le letture inverosimili e i guasti dei sensori devono essere segnalati, non corretti automaticamente senza lasciarne traccia nel profilo termico.
Il programma di temperatura a tre fasi di Tomorrow.bio
Il protocollo attuale prevede tre fasi distinte. I valori sono obiettivi operativi per questa apparecchiatura e per questo approccio crioprotettivo, non costanti universali valide per ogni sistema di vitrificazione.
1. Discesa rapida verso −130 °C
La prima fase porta il paziente dalla temperatura del ghiaccio secco fino a circa −130 °C, alla massima velocità compatibile con gli scostamenti di temperatura rilevati.
La velocità conta perché le regioni meno protette possono ancora formare ghiaccio prima che il tessuto passi allo stato vetroso.
Il computer non segue solo il tempo trascorso: monitora le termocoppie e regola l'ambiente di raffreddamento attorno al paziente.
2. Risalita controllata verso −120 °C
Dopo aver raggiunto circa −130 °C, il raffreddamento attivo viene ridotto e il paziente può riscaldarsi naturalmente verso circa −120 °C.
Si tratta di una fase di tempra. Vicino alla Tg, il materiale crioprotetto conserva una mobilità molecolare sufficiente a distendere parte dello stress meccanico accumulato.
La risalita consente inoltre alle regioni più calde e più fredde di riavvicinarsi termicamente, prima che il materiale venga ulteriormente raffreddato nello stato vetroso rigido.
La tempra non inverte danni biologici preesistenti. Il suo scopo è più circoscritto: ridurre i gradienti termici e le tensioni create dalla contrazione non uniforme.
3. Discesa a −196 °C a circa 1 °C all'ora
Da circa −120 °C, il raffreddamento programmato procede a circa 1 °C all’ora fino al raggiungimento della temperatura dell’azoto liquido.
Questo intervallo finale di 76 gradi richiede circa tre giorni, senza contare le pause e gli aggiustamenti del sistema di controllo.
Mantenere 1 °C all'ora in un corpo di grandi dimensioni e termicamente eterogeneo è un problema di controllo, non una semplice impostazione di un timer.
Il regolatore deve adattare continuamente l'ambiente del dewar affinché le termocoppie interne scendano insieme, senza generare gradienti eccessivi.
Quando una regione resta indietro, raffreddare forzatamente l'ambiente può raffreddare troppo un'altra regione. La precisione consiste nel bilanciare l'intero campo di sensori, non nel rincorrere una singola lettura.
Perché la fase di tempra è scientificamente plausibile
La ricerca sulla vitrificazione su larga scala individua due rischi contrapposti: un raffreddamento insufficiente al di sopra della Tg e tensioni meccaniche eccessive in prossimità e al di sotto della Tg.
Uno studio del 2024 sulla vitrificazione su scala di organo umano ha utilizzato più sonde interne e ha rilevato che la tempra riduce i gradienti prima dell’ingresso del materiale nello stato vetroso.
Lo stesso studio ha rilevato che un raffreddamento lento al di sotto della zona di tempra contribuisce a evitare la riformazione di gradienti termici e tensioni elevate.
Uno studio termomeccanico distinto ha rilevato che la tempra in prossimità della Tg modifica in modo sostanziale le tensioni residue e ne attenua la dipendenza dalla precedente velocità di raffreddamento.
Questi studi sostengono la strategia di controllo adottata. Non convalidano in modo indipendente ogni singolo setpoint del protocollo di Tomorrow.bio per l'intero corpo.
I corpi umani, nel loro insieme, sono più grandi e più eterogenei delle soluzioni o degli organi da laboratorio. Restano quindi necessarie registrazioni dirette della temperatura ed esami di diagnostica per immagini eseguiti dopo il raffreddamento.
Cosa registra il computer
Il dato utile non è un semplice messaggio del tipo «raffreddamento completato». È l'intera serie temporale proveniente da ogni canale di temperatura.
La registrazione deve mostrare velocità, pause, rimbalzi, gradienti tra i sensori, azioni del regolatore, allarmi e qualsiasi deviazione dalla curva prevista.
Questi dati diventano parte della valutazione della qualità della crioconservazione.
Dopo il raffreddamento, una tomografia computerizzata standardizzata eseguita alla temperatura dell’azoto liquido può rilevare la distribuzione dei crioprotettori, la presenza di ghiaccio, deformazioni evidenti e fratture che i soli dati di temperatura non possono evidenziare.
Perché terminare alla temperatura dell'azoto liquido
Alla pressione atmosferica standard, l’azoto bolle a circa 77,34 kelvin, corrispondenti a circa −195,8 °C, secondo il NIST Chemistry WebBook.
La conservazione in azoto liquido è passiva. Finché il contenitore contiene una quantità sufficiente di liquido, l’equilibrio di ebollizione mantiene stabile l’ambiente criogenico senza bisogno di refrigerazione meccanica.
La discesa controllata termina solo quando il paziente ha raggiunto le condizioni termiche necessarie per entrare in quello stato stabile. La conservazione non viene usata come sostituto del raffreddamento.
La progettazione e i compromessi della fase successiva sono illustrati nella sezione dedicata ai dewar criogenici moderni e alla conservazione a temperatura intermedia.
In breve: Tomorrow.bio utilizza un raffreddamento controllato da computer e sensori di temperatura interni. Il processo raffredda rapidamente fino alla transizione allo stato vetroso, riduce le tensioni termiche e poi prosegue lentamente verso −196 °C.
Esplori questo strumento pratico
Utilizzi lo strumento interattivo per esaminare la questione in questo articolo.
Caricamento dello strumento interattivo in corso...
Per saperne di più