La vitrificazione non è stata un'unica invenzione. Si è sviluppata risolvendo, uno dopo l'altro, problemi diversi relativi a cellule, embrioni, organi e, infine, alla biostasi umana.
L'obiettivo sembra semplice: raffreddare un tessuto ricco d'acqua fino a portarlo allo stato vetroso, evitando la formazione di ghiaccio dannoso.
La realizzazione non è semplice. Gli agenti crioprotettori possono essere tossici. Il loro caricamento può alterare le cellule. Gli oggetti di grandi dimensioni si raffreddano in modo non uniforme, accumulano tensioni interne e sono molto più difficili da riscaldare.
Le procedure moderne sono quindi sistemi, non ricette. La loro efficacia dipende dall'integrazione tra chimica, perfusione, controllo della temperatura, tempistiche, geometria e misurazioni.
Prima della vitrificazione: il freddo causava un secondo danno
Nelle prime fasi della crioconservazione si ricorreva soprattutto al congelamento. Il raffreddamento rallentava la chimica, ma l'acqua cristallizzava in ghiaccio.
Il ghiaccio espelle sali e altri soluti nel liquido residuo. Le cellule possono quindi subire contemporaneamente spostamenti meccanici, concentrazioni estreme di soluti, disidratazione e danni alle membrane.
Raffreddare più in fretta può rendere i cristalli più piccoli, ma l'acqua ordinaria richiede velocità straordinarie per diventare vetro senza aiuto chimico. Questo approccio è praticabile soltanto per campioni estremamente sottili.
Il problema storico non era semplicemente raggiungere una temperatura bassa. Era raggiungerla senza permettere all'acqua di riorganizzarsi in cristalli dannosi.
1937-1938: i primi esperimenti di vitrificazione cinetica
Basile Luyet propose la vitrificazione come strategia di conservazione biologica nel 1937.
Nel 1938, Luyet ed Eugene Hodapp riportarono il recupero della motilità in spermatozoi di rana esposti ad aria liquida dopo disidratazione con saccarosio concentrato.
L'esperimento originale si basava su film microscopici e su una velocità di raffreddamento estrema. Dimostrò una possibilità fisica, non un protocollo scalabile per organi.
Questo approccio viene oggi chiamato vitrificazione cinetica: superare la cristallizzazione rimuovendo calore più rapidamente di quanto il ghiaccio possa nucleare e crescere.
Il cambiamento di scala rende questo approccio impraticabile. La superficie cresce più lentamente del volume, quindi il centro di un campione grande non riesce a seguire la superficie con la stessa rapidità.
1949: la glicerina cambia il problema
Christopher Polge, Audrey Smith e Alan Parkes scoprirono nel 1949 che la glicerina poteva proteggere gli spermatozoi durante la conservazione a basse temperature.
Il loro articolo su Nature stabilì l'importanza pratica degli agenti crioprotettori penetranti.
Queste molecole entrano nelle cellule, legano l'acqua e riducono la quantità di ghiaccio che si forma a una data temperatura. Riducono inoltre l'aumento, potenzialmente dannoso, della concentrazione di soluti durante il congelamento.
La scoperta trasformò la criobiologia perché la velocità di raffreddamento non era più l'unica variabile di controllo. La composizione chimica poteva modificare il comportamento di fase dell'acqua.
Pose inoltre un nuovo problema di ottimizzazione. Più agente crioprotettore sopprime il ghiaccio in modo più efficace, ma aumenta il danno chimico e osmotico.
1959-1968: più agenti e caricamento graduale
Nel 1959, James Lovelock e Marcus Bishop riportarono che il dimetilsolfossido proteggeva diversi tipi di cellule dal danno da congelamento.
Il DMSO attraversava alcune membrane più facilmente della glicerina. Ciò ampliò la gamma di cellule crioconservabili e il DMSO resta tuttora molto usato nella conservazione in ambito di laboratorio e clinico.
John Farrant esplorò poi l'aumento della concentrazione di crioprotettore insieme all'abbassamento della temperatura, mantenendo il tessuto in un liquido concentrato senza formare ghiaccio deliberatamente.
Questo prefigurava una caratteristica centrale dei protocolli moderni: introdurre il crioprotettore gradualmente, a bassa temperatura, anziché esporre il tessuto ancora caldo alla concentrazione finale in un solo passaggio.
Il caricamento graduale limita lo shock osmotico. Una temperatura più bassa riduce molte velocità di reazione chimica e può rendere più tollerabile un'esposizione che sarebbe altrimenti dannosa.
Nel 1968, alcuni esperimenti mostrarono che i globuli rossi potevano raggiungere la temperatura dell'azoto liquido senza ghiaccio visibile, a condizione di una concentrazione di glicerina sufficientemente alta.
Erano già presenti tutti gli elementi concettuali fondamentali. Mancava ancora un modo pratico per applicarli a un tessuto complesso e vascolarizzato.
1984: la vitrificazione diventa una strategia per gli organi
L'articolo del 1984 «Vitrification as an Approach to Cryopreservation» presentò la vitrificazione come una strategia concreta per la conservazione degli organi.
La strategia fu talvolta chiamata vitrificazione di equilibrio. Anziché richiedere una velocità di raffreddamento irrealistica, questa strategia impiega una quantità di crioprotettore sufficiente a rendere raggiungibile la velocità critica di raffreddamento anche in sistemi più grandi.
Questo cambiamento portò alla luce tre vincoli collegati tra loro:
- La soluzione deve resistere alla formazione di ghiaccio alle velocità di raffreddamento e riscaldamento effettivamente raggiungibili.
- L'organo deve tollerare l'introduzione e la rimozione della soluzione crioprotettiva.
- Il crioprotettore deve raggiungere ogni regione prima che inizi il raffreddamento.
Una formulazione poteva funzionare perfettamente in provetta e fallire in un organo, perché resistenza vascolare, distanze di diffusione e tossicità ne condizionavano l'efficacia.
1985: embrioni vivi tornano da uno stato vetroso
William Rall e Gregory Fahy riportarono nel 1985 la crioconservazione senza ghiaccio di embrioni di topo a −196 °C.
Fu una dimostrazione biologica decisiva. Cellule vive e nucleate di mammifero potevano sopravvivere al raffreddamento e al riscaldamento dopo essere passate attraverso uno stato completamente vitrificato.
Gli embrioni restano comunque minuscoli. La loro temperatura e la loro concentrazione possono cambiare in modo rapido e uniforme, a differenza di quanto avviene in un organo adulto.
Il risultato convalidò il metodo, ma rese ancora più evidente il problema del passaggio a scale maggiori.
Il problema della scala si divide in quattro problemi
1. Tossicità dell'agente crioprotettore
La concentrazione necessaria per la vitrificazione può alterare proteine, membrane e metabolismo cellulare. La tossicità dipende dall'agente, dalla concentrazione, dalla temperatura, dal tempo di esposizione e dal tipo di tessuto.
Ciò significa che la minore tossicità non è una caratteristica intrinseca di una singola molecola. È una proprietà dell'intero protocollo di caricamento e scaricamento.
2. Stress osmotico
Aggiungere una soluzione concentrata fa uscire acqua dalle cellule. Rimuoverla può far rientrare l'acqua troppo rapidamente.
I protocolli moderni usano rampe di concentrazione, soluzioni vettore, controllo della temperatura e soluti non penetranti per contenere le variazioni di volume entro limiti tollerabili.
3. Distribuzione non uniforme
Un organo non è un volume omogeneo di liquido. Il crioprotettore viaggia attraverso i vasi, attraversa le pareti capillari e diffonde nel tessuto.
Coaguli, edema, malattie vascolari, ischemia e la barriera emato-encefalica possono lasciare alcune regioni sotto la concentrazione necessaria a sopprimere il ghiaccio.
Per questo, nei protocolli moderni di perfusione si misurano pressione, flusso, temperatura e concentrazione del perfusato venoso, anziché basarsi soltanto sul volume della soluzione impiegata.
4. Gradienti termici
Un oggetto di grandi dimensioni si raffredda dall'esterno verso l'interno. Temperature diverse provocano velocità di contrazione diverse.
Vicino e sotto la transizione vetrosa, il materiale non riesce a rilassare rapidamente le tensioni interne. Se la tensione supera la resistenza meccanica, possono formarsi fratture.
La soluzione consistette in un raffreddamento a velocità controllata, con una fase di ricottura vicino alla temperatura di transizione vetrosa, Tg, e una discesa più lenta nella regione vetrosa. Questi principi guidano oggi il raffreddamento umano controllato da computer.
Anni 1990 e 2000: le miscele sostituiscono l'approccio basato su un singolo agente
Nessun crioprotettore singolo ottimizzava ogni requisito. I ricercatori combinarono progressivamente diversi agenti penetranti, così da sfruttarne gli effetti senza dover portare ciascuno alla concentrazione più tossica.
Le soluzioni di base regolavano la composizione ionica, il pH e le condizioni osmotiche. I polimeri non penetranti influenzavano l'acqua tissutale e il comportamento vascolare.
Gli inibitori sintetici del ghiaccio agivano sui processi di nucleazione e sulla crescita eterogenea dei cristalli di ghiaccio. Riducevano così la dipendenza dalla sola concentrazione di crioprotettore.
Soluzioni come VS55 e, più tardi, M22 rappresentarono un approccio di ingegneria dei sistemi: più agenti, inibitori del ghiaccio e una soluzione di base studiata con cura, associati a protocolli definiti di perfusione e controllo termico.
Una rassegna del 2004 sulla vitrificazione degli organi descrive i progressi nella riduzione della tossicità, nel danno da freddo, nel controllo della nucleazione e nella perfusione degli organi.
Il progresso decisivo non consistette nell'eliminare la tossicità. I ricercatori impararono a distribuire il carico tossico tra chimica, tempo e temperatura.
Esperimenti sui reni di coniglio: importanti e facili da sopravvalutare
Il lavoro sui reni di coniglio dimostrò che un organo mammifero vascolarizzato poteva essere caricato con una soluzione di vitrificazione complessa, raffreddato allo stato vetroso, riscaldato e trapiantato.
Secondo quanto riportato, un singolo rene trattato fu in grado di sostenere un coniglio per un periodo prolungato, fungendo da unico rene funzionante.
Quel risultato conta perché segnò il passaggio dai campioni microscopici alla funzione d'organo. Non stabilì tuttavia una procedura clinica affidabile.
La letteratura successiva rileva che il successo del trapianto a lungo termine non fu ottenuto in modo riproducibile. Distribuzione, tossicità e il riscaldamento superficiale convenzionale restarono i fattori limitanti.
Questa è l'interpretazione corretta dei dati: una significativa prova di principio, ancora limitata da problemi di riproducibilità e di scala.
2015: la qualità della conservazione diventa visibile a livello sinaptico
La crioconservazione stabilizzata con aldeidi ha combinato fissazione chimica, perfusione di agenti crioprotettori e vitrificazione di cervelli di coniglio e di maiale.
Lo studio del 2015 riportò membrane, sinapsi, vesicole, mielina e strutture intracellulari chiaramente visibili dopo il riscaldamento e la preparazione per la microscopia elettronica.
Dimostrò che un'eccellente ultrastruttura neurale poteva sopravvivere a un ciclo di conservazione senza ghiaccio anche in cervelli di grandi dimensioni.
Non dimostrò un recupero vitale. La fissazione con aldeidi induce deliberatamente legami crociati nei tessuti biologici ed è incompatibile con il normale ripristino di una funzione vitale.
L'esperimento rispose quindi a una domanda sulla conservazione strutturale, non alla più ampia questione della rianimazione.
Il suo contributo più importante fu metodologico: la qualità della conservazione va valutata esaminando le strutture rilevanti, non limitandosi a osservare l'aspetto vitreo di un campione.
2023: il riscaldamento con nanoparticelle migliora il riscaldamento dei reni di ratto
Il raffreddamento è solo metà della crioconservazione reversibile. Il riscaldamento è spesso la parte più difficile.
Se il riscaldamento è troppo lento, il ghiaccio può crescere durante la devitrificazione. Se il calore arriva soprattutto dalla superficie, i gradienti termici possono fratturare l'organo.
Il riscaldamento con nanoparticelle affronta entrambi i problemi distribuendo nanoparticelle di ossido di ferro nella rete vascolare e scaldandole con un campo magnetico a radiofrequenza alternata.
Nel 2023, alcuni ricercatori hanno vitrificato reni di ratto, li hanno conservati fino a 100 giorni, riscaldati con nanoparticelle e poi trapiantati.
Durante il periodo di osservazione riportato, i reni trattati hanno ripristinato una funzione renale sufficiente alla sopravvivenza nei riceventi privi di reni propri.
Il risultato dipendeva da fattori che andavano oltre il solo riscaldamento. Il gruppo di ricerca adottò una formulazione meno tossica e modellò il caricamento del crioprotettore per migliorarne la concentrazione nel tessuto.
La storia della vitrificazione mostra ripetutamente che la soluzione di un problema può farne emergere un altro e che un recupero riuscito dipende dall'intera sequenza procedurale.
2024-2026: sistemi fisici più grandi e tessuto neurale funzionante
Nel 2024, alcuni ricercatori hanno riportato la vitrificazione fisica di sistemi di dimensioni paragonabili a quelle di un organo umano, con volumi da 0,5 a 3 litri.
Hanno combinato termometria interna, ricottura, raffreddamento controllato e analisi mediante micro-TC. Hanno inoltre dimostrato il riscaldamento con nanoparticelle in volumi fino a 2 litri.
Le dimostrazioni condotte su scala maggiore riguardavano soprattutto gli aspetti fisici del processo. Evitare ghiaccio e fratture visibili è necessario, ma non stabilisce il recupero biologico di un organo di dimensioni umane.
Nel 2026, uno studio pubblicato su PNAS ha riportato un recupero funzionale a breve termine del tessuto ippocampale di topo adulto dopo vitrificazione e riscaldamento.
Lo studio ha misurato morfologia, risposta mitocondriale, eccitabilità neuronale, trasmissione sinaptica e potenziamento a lungo termine.
Lo studio ha riguardato fette di cervello di topo e preparazioni di cervello intero a bassa resa, non un cervello umano. Il suo significato è più limitato, ma resta rilevante.
Ha mostrato che il tessuto neurale adulto dei mammiferi può recuperare funzioni elettrofisiologiche dopo un periodo in cui la mobilità molecolare è stata arrestata nello stato vetroso.
La biostasi umana eredita la scienza in condizioni più difficili
Gli esperimenti di conservazione degli organi iniziano con tessuto sano, tempistiche controllate e un accesso pianificato alla rete vascolare.
La biostasi umana inizia dopo l'accertamento legale della morte. Malattia, ischemia a caldo, coagulazione, edema, trasporto e malattie vascolari possono tutti compromettere la distribuzione del crioprotettore.
L'obiettivo immediato è la conservazione strutturale in vista di una possibile riparazione futura, non un trapianto reversibile realizzabile oggi.
Per questo, i risultati ottenuti in laboratorio non possono essere estesi direttamente ai casi umani.
Come Tomorrow.bio ha adattato la vitrificazione alle condizioni sul campo
Tomorrow.bio ha adattato la perfusione crioprotettiva dell'intero corpo all'impiego in ambulanze specializzate. La procedura può iniziare vicino al paziente, invece di attendere il trasporto in Svizzera.
Questo interviene su un fattore importante che la chimica non può compensare: la durata dell'ischemia prima della perfusione.
Il protocollo attuale impiega una formulazione basata su VM-1, adattata alla crioprotezione sul campo e al successivo trasporto in ghiaccio secco.
Un programma di ricerca EBF ha testato VM-1 in condizioni postmortem simulate, comprese tre ore di ischemia a caldo.
Il programma ha misurato l'indice di rifrazione del perfusato venoso, il tempo di perfusione, la variazione di peso, la contrazione del cervello e la formazione di ghiaccio, valutando al contempo modifiche del perfusato e della procedura.
Questa è oggi la principale sfida pratica nei casi umani: non stabilire se una soluzione ideale possa vitrificare i tessuti, ma valutare quanto efficacemente si possa perfondere una persona realmente ischemica.
La misurazione è diventata parte della procedura
Le prime ricerche sulla vitrificazione stabilivano spesso il successo attraverso trasparenza, calorimetria, diffrazione a raggi X, sopravvivenza o funzione dopo il riscaldamento.
Nella biostasi umana il recupero non è oggi un esito verificabile. Richiede quindi misure non distruttive, nonché valutazioni su campioni, della qualità della conservazione.
Tomorrow.bio esegue una tomografia computerizzata su ogni paziente alla temperatura dell'azoto liquido, per stimare la distribuzione del crioprotettore e individuare ghiaccio o difetti macroscopici in condizioni standardizzate.
Con un consenso specifico separato, i microcampioni neurali possono consentire una valutazione al microscopio elettronico di membrane, sinapsi e ultrastruttura locale.
Questi metodi e i loro limiti sono descritti nelle procedure di verifica della qualità della biostasi.
Le misurazioni contribuiscono direttamente al perfezionamento della procedura. Quando un difetto diventa osservabile e confrontabile tra i diversi casi, la formulazione chimica e il protocollo possono essere modificati in modo mirato.
Cosa è migliorato, e cosa resta da risolvere
La vitrificazione moderna ha raggiunto risultati che le prime tecniche di congelamento non potevano conseguire:
- Conservazione senza ghiaccio di molte cellule, embrioni e piccoli tessuti.
- Recupero funzionale di organi animali vitrificati in esperimenti definiti.
- Conservazione strutturale a livello sinaptico in cervelli mammiferi fissati.
- Raffreddamento e ricottura controllati da computer in sistemi più grandi.
- Riscaldamento volumetrico grazie a tecnologie come il riscaldamento con nanoparticelle.
- Metodi di tomografia computerizzata e microscopia elettronica per misurare i risultati reali della conservazione.
Non ha ancora prodotto una crioconservazione umana reversibile del corpo intero.
I problemi ancora aperti comprendono l'ischemia postmortem, la perfusione non uniforme, la tossicità del crioprotettore, gli effetti della barriera emato-encefalica, i gradienti termici sul corpo intero, la prevenzione delle fratture e un riscaldamento uniforme e sicuro.
Anche una conservazione strutturale riuscita non risolverebbe i problemi della futura riparazione dei tessuti, della rianimazione e del trattamento della causa originaria della morte.
Queste distinzioni sono approfondite nelle sfide tecniche per la crioconservazione reversibile.
In sintesi: la vitrificazione è migliorata grazie a crioprotettori più efficaci, perfusione, controllo del ghiaccio, raffreddamento, riscaldamento e misurazione strutturale. Alcuni problemi sono stati risolti su piccola scala, mentre la reversibilità dell'intero corpo umano resta una questione aperta.
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